Western Blot检测

 

      Western Blotting实验技术对外服
一、 威斯腾生物|WB技术服务简介:


免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。


二、威斯腾生物|WB实验仪器:

  

高速组织捣碎机: SWISS KINEMATIC Ltd. Co(型号:PT1600E

电泳仪:北京六一仪器厂(型号:DYY-8C

电泳槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-24D)    

转印槽:北京六一仪器厂(型号:DYCZ-40D)

低温高速离心机:湖南湘仪公司(型号:H2050R)

超低温冰箱:美国FORMA公司(型号:702

分光光度计:上海分析仪器总厂(型号:721)

脱色摇床:上海琪特分析仪器有限公司(型号:STS-2)


三、WB技术操作步骤:


样品准备

1)分别取大约200mg组织加入液氮碾磨成粉末状,按每200mg组织加900μl上样Buffer(无溴酚蓝)100ul 10mg/ml PMSF,混匀,玻璃匀浆器冰点匀浆;

2412000rpm离心10min;

3)取上清夜-70冻存24hr;

44 12000rpm再次离心10min,取上清分装,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100加热4min,后于-20保存待用。


定蛋白及计算电泳上样量

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量,电泳上样量定为40ug


电泳

1)安装好电泳装置;

2)根据不同的指标配制相应浓度的分离胶,灌胶约3/5体积,液封(<10%0.1%SDS,>10%用异丙醇);

330min后,待凝后倾去封液;

4)配5%的浓缩胶,灌胶至距平板顶部2mm处,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去离子水清洗加样孔,用滤纸吸干;

5)上样:各样品取50ug上样,marker10μl上样(上样前需按说明书进行预处理);

6)缓慢加入内、外槽缓冲液,接通电源,90v电泳至指示剂进入分离胶后,调电压至150V继续电泳;

7)当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳;


转膜及检测

1)准备212cm的平面皿,一个装去离子水浸泡NC20min,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min;

2)取下胶,切除浓缩胶部分后,将分离胶浸入转移缓冲液中约5min;

3)按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板);

4)完全排除气泡, 4,100mA转膜2h;

5)倾去转膜缓冲液,拆除转膜装置,将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min,用去离子水清洗至能看到条带,后用铅笔标出marker位置,再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右;

6)将膜转移至另一容器中,用5%脱脂奶粉封闭4过夜;

7)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗;

837摇床孵育约2h;

9PBST洗涤4次,每次5min;

10)将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗,37摇床孵育约30min;

11PBST洗涤4次,每次5min;

12)将膜转移至尽可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物,室温孵育30min;

13)取出NC膜,用蒸馏水漂洗后晾干;

14)扫描及分析。


四、威斯腾生物|WB服务要求:

1、样本要求:组织样品,每份样本约250-500mg,新鲜或正确保存的组织。细胞样本:每份样本:1*10 61*10 7细胞数。

2、客户提供有效的一抗,(国产抗体一般不接纳) 一抗自备或代购。

3、客户提供欲检测目的蛋白的详细背景资料。以及提供样本的种属,类型。


五、威斯腾生物|WB服务结果提供:
1、目的蛋白实验图片。

2、灰度分析结果。(免费分析)

3、内参结果。(免费跑胶)

4、详细的实验步骤。

5、免费提供蛋白样本保存液。


六、威斯腾生物|WB实验周期


接受样本后,1-2个月。


七、威斯腾生物|WB实验注意事项:


1
、客户要确保检测样本没有问题。

2、客户要确保抗体的有效性。

3、实验周期比较紧张的客户需特别说明。

4、收费标准:以每张膜8个样本收费,不足8个样本的按8个样本收费)


八、威斯腾生物服务流程:




九、威斯腾生物服务项目


分子生物学检测蛋白质与免疫学动物实验
实时荧光定量PCR单克隆抗体制备帕金森疾病模型
免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗体制备抑郁症动物模型
ELISA(酶联免疫吸附法)技术Western-blot 实验服务脊髓损伤模型
生化指标检测蛋白双向电泳实验服务脑外损伤模型
双荧光素酶报告基因检测原核蛋白表达纯化骨神经损伤模型
染色质免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表达纯化心肌缺血模型
GST pull DownITRAQ定量蛋白质组学心力衰竭模型
SLAC蛋白组学肺动脉高血压动物模型
高血压模型
病毒包装纯化实验课题整体外包粥样动脉硬化模型
过表达/干扰慢病毒包装纯化整体课题外包大脑中动脉阻塞模型
过表达/干扰腺病毒包装纯化细胞整体实验外包慢性之气管炎模型
逆转录病毒包装纯化动物整体实验外包过敏性哮喘模型
腺相关病毒包装纯化肺炎大鼠模型
肝炎-肝硬化-肝癌模型
蛋白芯片原代细胞培养肝纤维化模型
细胞因子芯片骨髓间充质干细胞培养胆结石模型
生长因子芯片脂肪干细胞培养急性胰腺炎模型
信号通路磷酸化水平检测芯片心肌成纤维细胞培养急性肾衰竭模型
BioPlex悬浮芯片软骨细胞培养体内血栓模型
生长因子芯片血管内皮细胞培养关节炎模型
炎症因子芯片神经元细胞培养I型和II型糖尿病模型
血管生成因子芯片内皮组细胞原代培养裸鼠成瘤
凋亡因子芯片基因编辑动物
趋化因子芯片电生理相关服务动物整体实验服务
HuProt TM 20K人类蛋白组芯片膜片钳实验
细胞生物学高通量测序代谢组学
细胞原代培养mRNA测序气相色谱GC/MS
MTT检测LncRNA测序液相色谱LC/MS
细胞凋亡检测全基因组测序核磁共震NMR
细胞周期检测RNA-Seq测序
细胞克隆形成实验外显子测序影像学相关实验
Transwell细胞迁移/侵袭16s扩增子测序Micro-CT
流式分选Small RNA测序小动物活体成像
CCK8/XTT检测宏基因组测序核磁共振
台盼蓝检测细胞活性单细胞测序PET-CT
药物筛选细胞学实验circleRNA测序
细胞粘附性检测甲基化测序基因编辑动物
细胞划痕实验条件性敲除小鼠/大鼠
细胞生物学整体实验全基因敲除小鼠/大鼠
细胞成管实验
病理学检测CRISPR/Cas9细胞敲除/敲入基因芯片
扫描电镜基因定点突变细胞系LncRNA芯片
透射电镜单基因敲除细胞系miRNA芯片
HE染色多基因敲除细胞系mRNA芯片
免疫组化目的基因敲入细胞系甲基化芯片(限人和小鼠来源样本)
Tunel(原位末端凋亡法)检测报告基因敲入细胞系SNP芯片(限人和小鼠来源样本)
激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除细胞系
免疫荧光
Masson染色CRISPR/Cas9动物敲除/敲入科研方案设计与SCI相关服务
原位杂交基因敲除大鼠/小鼠科研文献论著翻译
荧光原位杂交基因敲入大鼠/小鼠SCI论文翻译润色服务
特殊染色(PSA、茜素红、阿尔新蓝等)临床实验/科研实验设计方案指导
行为学检测药物筛选服务项目药效学评价
水迷宫实验高通量自动药物筛选平台神经系统药物药效学评价
旷场实验细胞高内涵药物筛选平台抗肿瘤药物药效学评价
重复性刻板行为检测蛋白质组学靶标研发平台心血管系统药物药效学评价
动物跑台检测分子药理研究平台泌尿系统药物药效学评价
强迫游泳生物膜片钳药物筛选平台内分泌系统药物药效学评价
常规药物体外筛选抗炎免疫药物药效学评价

 


【本平台合作项目】
分子生物学、细胞生物学、基因敲出/入、模式动物、SPF动物保种、病理学检测、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务! 
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