SNP筛查和鉴定——DHPLC法


SNP
筛查和鉴定——DHPLC
 


简介:
人类基因组中存在着广泛的多态性,最简单的多态形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代,即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)。SNP的数量大、分布广,在组成人类基因组30亿个碱基中,平均每1000个就有一个SNPSNP作为第三代遗传标记,在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学的研究中发挥着愈来愈重要的作用。为适应日益增长的 SNP研究需求,和各类客户的不同需要,威斯腾生物中心利用多套技术方案为不同客户提供量身定做的个性化服务。


 

DHPLC高端变性高压液相色谱)法:

 

特点:

1、拥有高端变性高压液相色谱仪(WAVE 3500HT)等仪器设备,配备有国内领先和国际一流水平的研究队伍。

2、采用DNA样品池法(将若干份PCR样品混合在一起),使得纯合突变也能以杂合子形式得以捡出,极大提高了寻找未知SNPs的效率。

3、  具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点

4、  检测所需的样品量很少,PCR产物高于80ng就能满足实验要求,且无需纯化,实验重复性好

5、  上机时间短,只需5~6min就可得出数据

6、  根据峰图可判断是否有突变,但不能确定SNP的位置和类型,需用标准样品或结合测序验证


原理:

DHPLC基因突变筛查,就是利用离子对反向液相色谱技术,通过独特的DNA分离基质,对特定的PCR反应产物进行分离。含有突变位点的PCR扩增产物经变性、逐步降温退火后,将形成同源和异源双链(一条为突变链,另一条为正常链)两种DNA分子.在部分变性条件下,发生错配的异源双链DNA更易于解链为单链DNA,与DNAsep柱结合力降低,比同源双链DNA分子更易于被乙腈洗脱下来,从而与同源双链DNA分离.一般来说,含变异成分的PCR产物将在DHPLC图谱上比PCR非变异产物多1-2个峰型,因而两者可以被鉴别.

实验流程:

1DNA提取,设计引物并合成

2PCR

3、上机检测,数据采集以及分析

 

客户需知:

1准确的基因名称和序列以及SNP位点信息

2A、组织或血液样品B、基因组DNA 样品,需-20度保存和运输

3、纯度要求:OD260/2801.6~1.8之间;OD260/2301.8~2.2之间

4、浓度要求( C) :基因组DNA浓度大于100ng/µl    

5DNA用量需求( UL):PCR反应个数(N* M/ C

6、单个PCR反应量(M)50ng

7PCR产物大小在150~800bp之间,最好在300bp左右,里面不含矿物油、甲酰胺、高压灭菌水、蛋白酶 K、牛血清白蛋白

8、为了提高 PCR 扩增的保真性,最好选用 Pfu DNA 聚合酶

 

结果提供:

1、提供每个PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图片

2、提供电子版结果及实验流程

3、提供数据分析服务

4、实验数据及实验剩余的样品和引物为客户所有

 

实验费用:

1、   DNA提取费用

2、   引物设计及合成费用

3、   PCR扩增费用

4、   上机费用

5、   数据分析费用


附:HPLC其他应用领域

工作模式

温度范围

应用范围

分离原理

非变性

50

鉴定双链DNA片段长度(小于2000bp

按片段长度分离,与序列无关

PCR产量检查和产物纯化

定量分析(Q-RT-PCR

部分变性

52-75

(平均范围)

突变检测

依靠片段大小和序列分离

单核苷酸多态性(SNP)研究

完全变性

 

75-80

(平均范围)

 

鉴定单链DNA片段长度(小于2000bp

依靠片段大小和序列分离

RNA分析 (用RNASep柱)

寡核苷酸分析(DNASep柱与OLIGOSep 柱)和纯化(片段收集器)。大量纯化需用OLIGOSepPrepTM HC




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