蛋白质在发挥作用时都不是孤立的,而是相互联系的,蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,对调控细胞及其信号有重要意义。蛋白质互作研究按照实验目的可分为两大类,一是筛选某个兴趣蛋白的互作蛋白,二是验证两个蛋白是否存在相互作用。威斯腾生物提供以下多种技术,帮助科研工作者从多个角度解析生物体内的蛋白质相互作用网络。

筛选相互作用的蛋白

技术方法 技术特点 验证方法 适用样本
酵母双杂交 将报告基因的转录因子GAL4基因分成GAD和GBD两个区域,分别构建对应的两个融合蛋白GAD-Y和GBD-X,如X和Y有相互作用,将会启动GAL4基因的表达,进而观察到报告基因的表达。 报告基因 文库筛选
Co-IP-MS 利用二级质谱技术,分离并鉴定Co-IP技术洗脱下来的蛋白质复合物 MS 细胞
pulldown-MS 利用二级质谱技术,分离并鉴定Pulldown技术洗脱下来的蛋白质复合物 MS 原核表达蛋白、细胞
蛋白质组芯片 通过诱饵蛋白与芯片上包被的近2万种背景信息清晰的全长蛋白质进行互作反应,覆盖81%的人类基因组ORF区。 芯片技术 种属为人的体外表达蛋白,纯化蛋白质
AP-MS 将亲和纯化标签与诱饵蛋白构建成为重组融合蛋白,利用标签亲和纯化,并利用二级质谱技术,分离并鉴定洗脱下来的蛋白质复合物 MS 细胞

Co-IP 免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 细胞在非变性条件下被裂解时,细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads或者magnetic beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。

Co-IP这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于筛选一种特定蛋白质的结合蛋白。

验证相互作用的蛋白

技术方法 技术特点 验证方法 适用样本
荧光共定位
Fluorescence co-localization
以抗原-抗体反应为基础,通过荧光标记,直观展现两个蛋白在细胞内的结合情况 激光共聚焦显微镜拍摄 细胞/组织
Co-IP-WB 以抗体-抗原反应为基础,验证两个蛋白在细胞内的天然结合 WB 细胞
pulldown-WB 以标签蛋白和固相介质的亲和作用为基础,验证两个蛋白在体外条件下的结合情况 WB 原核表达蛋白、细胞

荧光共定位

荧光共定位(Fluorescence co-localization)是对样品内两种荧光标记的信号共同分布的位置进行分析,通常有“基因-标签”融合蛋白表达和免疫荧光两种方式。共定位就如字面意思上所说的,只能够表明蛋白A和B都在此细胞有表达,并且在同样的细胞内位置/细胞器,是说明两个蛋白存在直接或间接相互作用的细胞学佐证,这个技术一般用于细胞内辅助证明蛋白相互作用,可以作为其他蛋白质相互作用研究方法的辅助检测手段。

联系我们

欢迎来电、来函接洽!